超凈工作臺(tái)在纖維細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的使用

近年來(lái)，隨著組織工程及再生醫(yī)學(xué)的迅猛進(jìn)展脂肪干細(xì)胞鑒于其取卡材便利，來(lái)源豐富，低免疫性及多分化潛能等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為人們研究的熱門(mén)。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潛能在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，很少關(guān)照ADSCs分泌功能在組織損傷修復(fù)中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用超凈工作臺(tái)并觀測(cè)研究了ADSCs分泌功能對(duì)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)影響，探討ADSCs分泌功能促創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

材料和方法

1 主要儀器與試劑：DMEM培養(yǎng)液、胰酶、I型膠原酶、二甲基亞砜、MTT、小牛血清，胎牛血清，annexinV凋亡檢測(cè)試劑盒，Mondel680型酶標(biāo)儀，垂直流超凈工作臺(tái)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，顛倒顯微鏡，流式細(xì)胞儀。

2 ADSCs分離與培養(yǎng)：取腹部外科手術(shù)患者皮下脂肪組織約59，無(wú)菌條件下用剪刀剔除血管及其它組織碎片，用含雙抗的PBS液反復(fù)浸泡沖洗3次，每次約5min，用眼科剪將脂肪組織剪成約lmm3的碎塊，置于0．1％的I型膠原酶中于37℃水浴振蕩消化1h；加入等體積l0％胎牛血清精細(xì)消化后，用200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，600g離心lOmin，棄去上層脂肪及上清液，沉淀用含l0%胎牛血清培養(yǎng)液重懸接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％的C02培養(yǎng)箱中陳規(guī)培養(yǎng)。2天后換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80％時(shí)傳代培養(yǎng)。

3 3ADSCs培養(yǎng)上清液的制備：選擇生長(zhǎng)良好第3代．ADSCs細(xì)胞接種于75cm2的培養(yǎng)瓶，生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，換成尢血清培養(yǎng)液DMEM15ml，培養(yǎng)3天后，搜集上清液。上清液經(jīng)O．22μm的濾膜過(guò)濾．分裝，一80。C凍存?zhèn)溆谩?/p>

4 人皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)：用組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，置于10％小牛血清培養(yǎng)液中，置于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中陳規(guī)培養(yǎng)。

5 成纖維細(xì)胞增殖的測(cè)定：采納MTT法測(cè)定。傳代時(shí)取第3代成纖維細(xì)胞以3×10／孔接種于12孔板，陳規(guī)培養(yǎng)24h后棄上清，設(shè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)比組，實(shí)驗(yàn)組均用ADSC-CM及2％小牛血清配制，對(duì)比組僅用2％小牛血清培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組加對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液lml，連續(xù)培養(yǎng)3天后，每孔分別加入5g／L的MTT100μl，37℃、5％C02孵育4h后，精細(xì)培養(yǎng)：吸棄上清液，每孔加入750μl。二甲基亞楓，連續(xù)孵育lOmin后稍微振蕩使紫藍(lán)色沉淀融解，然后以150μl／孔移動(dòng)至96孔板，每孔反復(fù)5次。用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

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